Наши проекты
- Профилирование протеомными методами экспрессии белков при гепатотоксичности
Монооксигеназная система микросом печени отвечает за окислительный метаболизм разнообразных химических веществ, включая лекарства, канцирогены, пистециды, промышленные выбросы, а также эндогенные вещества такие как стероидные гормоны. Хорошо описана индуцибельность монооксигеназной системы. Изчестно что введение фенобарбитала мышам приводит к индукции нескольких микросомальных белков, таких как цитохром P450 2B, NADPH-флавопротеин и цитохром b5. Используя протеомные методы нами обнаружено значительное увеличение экспрессии более чем 30-ти других микросомальных белков, и некоторых цитозольных белков, в частности шаперонов. Эти данные позволяют более детально понять механизм метаболизма P450 и фармако-молекулярный ответ некоторых лекаственных терапий.
- Многомерный анализ протемных карт термостабильной фракции сыворотки крови больных с различными видами опухолей
Сыворотка крови является наиболее часто применимой в диагностике биологической жидкостью. С целью выявления возможности использования сыворотки для диагностики онкологических заболеваний были проведены протеомные исследования. Термостабильные фракции сыворотки от больных раком яичника, матки, груди и доброкачественной опухоли матки были проанализированы двумерным электрофорезом комбинированным с времяпролетной масс-спектрометрией. Было идентифицировано 38 белковых пятен на протеомных картах, отражающих наличие онкологических процессов у больных, и относящиеся к гаптоглобину, транстиретину, апопротеину A-I, апопротеину A-IV, апопротеину D, апопротеину J, Zn альфа гликопротеину, альфа 2 HS гликопротеину, антитрипсину и фибриногену. Различные назологические формы онкологических заболеваний были четко классифицированы используя многомерный (мультипротеиновый) анализ основанный на применении упругих карт к измеренной оптической плотности этих белков. Неспецифические изменения свойственные всем опухолям, и специфические, присущие отдельным назологиям, были выявлены анализом принципиальных компонент примененным к упругим картам. Результаты исследования позволют рассматривать двумерные протеомные карты как мультипротеиновые диагностические панели для дифференциальной диагностики назологических форм онкологических заболеваний.
- Экспертная система для SDS-PAGE/MALDI-TOF профилирования протеомов
Времяпролетная масс-спектрометрия сегодня является наиболее часто применимая техника в протеомных исследованиях. Созданные поисковые системы позволяют статистически достоверно идентифицировать белки используя MALDI-TOF масс-спектры их протеолитических фрагментов. Однако, предварительное эффективное разделение белков, такое как 2D-PAGE, является необходимым условием успешного анализа. Замена же трудоемкого и дорогостоящего двумерного разделения более простым одномерным, таким как SDS-PAGE, приводит к необходимости анализа спектров смеси белков, интерпретация которых трудоемкая задача даже для искушенных в этой области специалистов. Таким образом, создание экспертной системы для протеомных исследований основанных на одномерном электрофоретическом разделении является крайне актуальной задачей, особенно в виду того, что SDS-PAGE является методом выбора при протеомных исследованиях мембранных белков. Целью проекта является разработка программного обеспечения для протеомного профилирования биологических объектов на основе одномерного электрофоретического разделения совмещенного с масс-спектрометрической идентификацией. Используемый алгоритм основан на применении теоремы Байеса, MOWSE, Z-score, корреляции между теоретически рассчитанным и представленным в спектре распределении масс пептидов, расчете вероятности наличия паттерна протеолиза в пептидном фингерпринте, а также обработке полученных данных искусственным интелектом. Эффективность алгоритма была протестирована на примере протеомного профилирования Helicobacter pylori с разделением белков одномерным электрофорезом.
- Взаимодействие хозяин-патоген. Системный анализ клинических изолятов Helicobacter pylori
Изменчивость генома H.pylori стоит на первом месте среди исследованных на сегодняшний день бактерий. Таким образом, проект направленный на исследование регуляции мРНК и экспрессии протеинов требует данные об изменчивости нуклеотидов как на генном, так и на нуклеотидном уровнях. В нашем исследовании четыре клинических изолята Helicobacter pylori и референс штамм J99 были проанализированы различными методами. Геномное сканирование и оценка уровня экспрессии были проведены для этих изолятов используя ДНК-чиповую технологию. Параллельно были проанализированы протеомы этих изолятов. Путем сравнения геномов было показана критически высокая вареабельность некоторых групп генов, включая островок патогенности cag. Результаты по нескольким ДНК чипам были подтверждены на протеомном уровне. Выявлена корреляция между изменениями в структуре белковых пятен и нуклеотидными заменами (частоты мутаций синонамичных и асинонамичных сайтов). На основе полученных данных могут быть установлены закономерности регуляции экспрессии в системах рестрикции и модификации H.pylori. Основное заключение по результатам исследования заключается в том что разнообразие H.pylori не только в описанных данных по геному и протеому бактерии, но и в их взаимосвязи.
- Мониторинг в реальном времени образования комплексов: белок/белок, белок/липид, фермент/ингибитор, белок/нуклеиновая кислота, олигонуклеотид/олигонуклеотид и т.д.
Методом Кресонантного зеркала - оптического биосенсора были исследованы в реальном времени формирование двойных и тройных комплексов водорастворимыми цитохромами P450cam (P450cam), а также мембранными P4502B4(2B4)- и P450scc-содержащими монооксигеназными системами. Данный метод позволяет вычислять константы ассоциации (диссоциации) формирующих комплексы реакций. Так на поверхности чипа биосенсора был создан фосфолипидный слой и измерена кинетическая константа белок/мембранного взаимодействия. Для определения энтропии и энтальпии реакции была измерены температурные зависимости образования комплекса трипсин/ингибитор, а также других комплексов. В работе использовались оптические биосенсоры IAsys и Iasys+ (Affinity Sensors, Великобритания).
- Разработка методов диагностики заболеваний на основе оптических биосенсоров
Нами создан оптический биочип к оптическому биосенсору IAsys+ для диагностики гепатитов В и C. Биочип позволяет обнаруживать маркеры гепатитов B и C в сыворотке больных в течении 10 минут, таким образом биочип пригоден для экспресс диагностики гепатитов.
- Разработка оптических биосенсоров для диагностики заболеваний
Ведется создание оптического биосенсора для диагностики основанной на CD-ROM. Биочип с иммобилизированными биомолекулами (например антигеном) на CD-ROM позволяет аффинно абсорбировать маркеры (антигены) болезней. Сформированные таким образом комплексы антиген/антитело регистрируются лазерным лучем СD-ROM привода компьютера.
- Визуализация биомолекул и молекулярных комплексов методом атомно-силовой микроскопии
Была применена атомно-силовая микроскопия (АСМ) для визуализации и исследования структуры отдельных молекул и их комплексов как водорастворимых, так и мембранных мультипротеиновых систем (напаример: восстановленых монооксигеназных P450cam, P450scc, P4502B4 систем, антиген/антитело). Метод примененный в исследовании позволяет различать мономерные белки в бинарных и тройных комплексах. В работе использовался атомно-силовой микроскоп Solver P47 H (NT-MDT, Россия).
- Разработка диагностики заболеваний на основе атомно-силовой микроскопии
Создание биочипов и разработка АСМ диагностики гепатитов B и C на основе анализа структуры комплекса антиген/антитело.
- Определение размеров биомолекул в смесях методом лазерной корреляционной спектроскопии
Проводили измерение распределения масс молекул в многокомпонентных смесях используя лазерный корреляционный спектроскоп LKS-03 (Санкт-Петербург), а также осуществляли мониторинг примесей в лекарственных препаратах и биологических жидкостях.